上QQ阅读APP看书，第一时间看更新
第四节 血型血清学常用检查方法
一、抗球蛋白试验
抗球蛋白试验( antiglobulin test，AGT)又称Coombs试验，是检查红细胞上是否致敏有IgG抗体(直接抗球蛋白试验)或血清中是否存在IgG抗体(间接抗球蛋白试验)的一种经典方法。当血清或血浆中的IgG抗体致敏到红细胞上，或红细胞膜上本身就致敏有抗体，通过加入抗人球蛋白( antihuman globulin，AHG)的“桥连”作用，使红细胞表面的IgG抗体与抗人球蛋白抗体发生特异性反应，形成肉眼可见的红细胞凝集。抗人球蛋白除可以测定红细胞上IgG抗体外，也可以测定补体组分( C3、C4)。所谓多特异性AHG，即包括抗IgG和抗C 3抗体。
(一)直接抗球蛋白试验 【原理】
利用抗球蛋白可与体内已被IgG抗体或补体致敏的红细胞产生凝集反应，用于检查红细胞膜上是否已被IgG抗体所致敏。直接抗球蛋白试验( direct antiglobulin test，DAT)常用于新生儿溶血病(胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏)、溶血性输血反应(输入的不相合红细胞被受血者不完全抗体致敏)、自身免疫性溶血性贫血(患者红细胞被自身抗体致敏)以及药物诱导产生的自身抗体(由甲基多巴类药物、青霉素等所致)的检测。
【试剂与器材】
1.抗人球蛋白( AHG)试剂 多特异性抗球蛋白试剂，或抗-IgG和抗C3d。
2.对照试剂 盐水或6%白蛋白。
3. IgG致敏的试剂红细胞。
【操作】
1.将EDTA抗凝的血样用生理盐水配制成2%～ 5%的红细胞。
2.向测定管和对照管中分别加入1滴2%～5%红细胞悬液。
3.生理盐水洗涤3～4次，最后一次洗涤，除尽上清液。
4.立即向测定管中加入抗人球蛋白试剂1滴，向对照管中加入1滴盐水或6%白蛋白，混匀。
5. ( 900～1000)×g离心15秒。
6.观察凝集情况，评分并记录结果。
7.若测定管中未观察到凝集，向含有抗球蛋白试剂的试管中加入IgG致敏红细胞，( 900～1000)×g离心15秒，观察并记录结果，确认阴性结果的有效性。
【结果判定】
1.立即离心测定管出现凝集，而盐水或6%白蛋白对照管未出现凝集，直接抗球蛋白试验( DAT)为阳性。
2.如果盐水或6%白蛋白对照管在离心后出现凝集，则实验结果无效。
3.如果实验过程中未观察到凝集，加入IgG致敏红细胞后发生凝集，则DAT为阴性。如果IgG致敏细胞不凝集，阴性结果无效，需重复实验。
【注意事项】
1.在有激活的补体存在的情况下，可使用单特异性AHG试剂。
2.进一步确认致敏在被检红细胞上的是IgG或是补体，可采用单特异性抗IgG和抗C3dg。
3. DAT阴性不一定证明红细胞上没有结合球蛋白分子，多特异性和单特异性抗IgG试剂的检测灵敏度可达150～500个IgG分子/红细胞，但患者体内红细胞上IgG包被数即使低于此水平，仍会发生自身免疫性溶血性贫血。
4.盐水或6%白蛋白对照管出现凝集，提示可能存在冷自身凝集素或温反应性IgM/IgG抗体导致的自发凝集。37℃孵育红细胞或用温( 37℃)盐水洗涤，可消除冷自身抗体的反应。自身凝集需要用二硫苏糖醇( DTT)或2-氨乙基异硫脲溴化物( AET)处理红细胞。
5.初检可只用多特异性抗球蛋白试剂。如果DAT阴性，不需要后续试验。如果DAT阳性，再用单特异性试剂(抗-IgG和抗补体)做DAT，以确定是何种球蛋白。
6.脐血标本中含有华通胶，可能需增加洗涤次数。
7.可用柱凝集卡(抗-IgG卡)进行DAT。在进行柱凝集试验时需注意样本中尽量不含凝块、纤维蛋白，以避免假凝集。
(二)间接抗球蛋白试验 【原理】
间接抗球蛋白试验( indirect antiglobulin test，IAT)是一种检测血清中不完全抗体或补体的方法，即用已知抗原表型的红细胞测定受检血清中是否含有相应的不完全抗体( IgG抗体)，或用已知特异性的抗血清测定受检红细胞上是否含有相应抗原。本试验常用于血型鉴定、抗体的筛查和鉴定、输血前交叉配血试验以及其他特殊研究。
【试剂与器材】
1.生理盐水。
2.抗人球蛋白( AHG)试剂，可按需要，使用多特异性或单特异性抗IgG。
3. O型抗筛细胞。混合O型抗筛细胞只能用于献血者检测。患者样本必须使非混合细胞。
4.生理盐水配制的2%～5%献血者红细胞悬液。
5. IgG致敏的试剂红细胞。
【操作】
1.向正确标记的试管中加2滴血清或血浆。
2.每管中，加2%～5%试剂O型红细胞盐水悬液或献血者红细胞悬液1滴，混匀。
3. ( 900～1000)×g离心15秒，观察溶血和凝集情况，评分并记录结果。
4.37℃孵育30～60分钟。
5. ( 900～1000)×g离心15秒，观察溶血和凝集情况，评分并记录结果。
6.生理盐水洗涤红细胞3次或4次，最后一次洗涤尽量移除上清。
7.向红细胞扣里加入AHG，充分混匀。
8. ( 900～1000)×g离心15秒，观察凝集，评分并记录结果。
9.加入IgG致敏的试剂红细胞确认阴性结果的有效性。
【结果判定】
1.37℃孵育后，出现凝集/溶血为阳性结果。
2.加AHG后，出现凝集为阳性结果。
3.初次离心未观察到凝集，加IgG致敏红细胞后，离心出现凝集为阴性结果。
4.如果加入的IgG致敏的试剂红细胞离心后未凝集，阴性结果无效，实验需重做。
【注意事项】
1.质控 输血前对不规则抗体的检测实验，需每日使用弱抗体进行监控。质控血清可用6%牛白蛋白稀释定型用抗血清试剂至IAT反应2 +强度，也可用人源IgG抗体。
2.在间接抗球蛋白试验中，可使用白蛋白、低离子强度溶液( LISS)、PEG来加快并增强抗原-抗体反应。加22%牛白蛋白后，37℃孵育时间为15～30分钟;加LISS后，孵育时间为10～15分钟;加4 滴20% PEG后，孵育时间为15分钟。加PEG的实验，37℃孵育后没有直接离心看结果这一步，因为红细胞无法重悬。
3.可使用单特异性抗IgG试剂替代多特异性AHG，以避免结合C3的自身抗体造成不必要的阳性反应。
4.使用PEG时，由于血清球蛋白浓度提高，会出现血清蛋白沉淀现象。当IgG致敏红细胞不反应或反应很弱时，这一问题会很明显。在AHG介质中，至少4洗红细胞，并充分摇匀、重悬红细胞通常可防止问题发生，或者用不加PEG的方法重复一次实验。
5.操作步骤6～9需连续完成，不可中断。
二、唾液中ABH血型物质测定
【原理】
约78%的个体带有 Se基因，可分泌水溶性ABH抗原至除脑脊液外的体液中。这种分泌型抗原可通过ABH抗血清对唾液的抑制试验来检测。
【试剂与器材】
1.唾液的留取 在小烧杯或广口试管中收集唾液5～10ml。大多数人可在几分钟内积累到这一数量。为促进唾液分泌，可嚼石蜡或干净的橡皮圈，但不要嚼口香糖或含糖/蛋白的物品。( 900～1000)×g离心8～10分钟，将上清液转移至一干净试管，沸水浴8～10分钟，灭活唾液酶。( 900～1000)×g离心8～10分钟，收集透明或略带乳白色的上清液。用等量生理盐水稀释上清液。如果样本采集当天不进行实验，应将样本放于－20℃冻存。冻存样本可保持活性数年之久。
2.人(多克隆)抗A和抗B试剂。
3.荆豆来源的市售抗-H凝集素或用荆豆种子盐水抽提物制备的抗-H。
4. A 1、B、O型红细胞。
5.来自已知分泌型和非分泌型个体的冷冻/新鲜唾液，分别作为阳性和阴性对照。
【操作】
1.倍比稀释要用的分型试剂:检测A物质用抗A、检测B物质用抗B、检测H物质用抗-H。
2.每1滴稀释的分型试剂，分别加入对应的2%～5%红细胞( A、B、O)盐水悬液1滴。1000×g离心15秒，肉眼观察凝集情况，选择凝集强度2 +的最高稀释度。
3.在4支试管中各加1滴正确稀释的定型试剂。检测ABH抗原，试管上标记“分泌”、“非分泌”、“盐水”和“待检”。
4.向“分泌”、“非分泌”和“待检”管中各加1滴对应分泌型个体的唾液，在“盐水”管中加1滴盐水。
5.混匀，室温孵育8～10分钟。
6.根据检测的目标抗原，每管中加1滴2%～5%洗涤过的指示红细胞悬液( A、B、O)。
7.混匀，室温孵育30～60分钟。
8. ( 900～1000)×g离心15秒，肉眼观察细胞扣凝集情况。
【结果判定】
指示红细胞被抗体凝集，说明唾液中没有相应抗原。指示细胞不被抗体凝集，说明唾液中含有相应抗原。盐水对照管中的抗体不能凝集指示红细胞，说明实验无效。无效实验通常说明试剂被过度稀释，需重新确定适宜的稀释度，再重复实验。
【注意事项】
之前已检测过的分泌( Se)和非分泌( sese)个体的唾液可分别作为阳性和阴性对照。已知分泌/非分泌型个体的唾液可分装冻存，以备后用。
三、吸收试验
【原理】
血清中的抗体可以通过表达相应抗原的红细胞吸收除去。抗体被吸收后，分离血清和细胞，相应的抗体仍结合在红细胞上。通过放散试验，可收集结合的抗体。检测吸收后的血清，可鉴定吸收后剩余的抗体。吸收试验常用于:分离多抗体血清;吸收自身抗体，以检测可能被掩盖的同种抗体;制作血清试剂时，除去不要的抗体(通常是抗A、抗B) ;用已知特异性的抗血清，通过吸收试验证明红细胞上存在相应抗原;用已知抗原表型的红细胞，通过吸收试验可证明抗体的特异性。
【试剂与器材】
1.待吸收的血清或血浆。
2. (自体或异源)红细胞，应有待吸收抗体所对应的抗原。
【操作】
1.盐水洗涤红细胞至少三次。
2.红细胞末次洗涤后，( 800～1000)×g离心至少5分钟，尽量除尽上清液。残余盐水可用滤纸条吸尽。
3.混匀适量体积的压积红细胞和血清，在适宜的温度下孵育30～60分钟。
4.孵育过程中，定时混匀血清和细胞。
5.红细胞( 800～1000)×g离心5分钟。如有条件，在孵育温度下离心，防止抗体从红细胞膜上解离。
6.将上清液(被吸收的血清)转移至干净的试管。如要放散液，保留红细胞。
7.取部分吸收后的血清反应，和保留的未用过的吸收红细胞反应，以检查是否所有抗体都被吸收。
【结果判定】
如果吸收后血清仍有活性，证明抗体未被完全吸收。血清不反应，证明抗体被完全吸收。
【注意事项】
1.压积红细胞和血清可按等体积加入，也可根据实际情况，加大红细胞或血清的量。IgG抗体的最适吸收温度为37℃，IgM抗体的最适吸收温度为4℃。
2.如果红细胞和血清的接触面积较大，吸收会更有效。推荐使用大口径试管( 13mm以上)。
3.抗体要完全除尽，可能需多次吸收。但每增加一次吸收，血清被稀释的可能性会增加，未被吸收的抗体会减弱。
4.重复吸收时，要用新的红细胞，而非之前吸收过的红细胞。
5.对于耐酶处理的抗原，可用酶处理红细胞，以增强对相应抗体的吸收。
四、放散试验
【原理】
红细胞上的抗原与血清中抗体在适合条件下发生凝集或致敏，这种结合是可逆的，如改变某些物理条件，抗体又可从结合的细胞上放散，再以相应的红细胞鉴定放散液内抗体的种类并测定其强度，用以判定原来红细胞上抗原的型别。这种方法常用于ABO亚型的鉴定、全凝集或多凝集红细胞的定型、类B的鉴定以及新生儿溶血病的诊断等。
放散试验的方法很多，ABO血型新生儿溶血病的IgG抗A、抗B以及IgM血型抗体以热放散法为常用。Rh血型IgG抗体以乙醚放散法为常用。
1.热放散法 【试剂与器材】
( 1)直接抗球蛋白试验( DAT)阳性红细胞，用大量盐水洗涤4～6次。
( 2)待放散红细胞末次洗涤的盐水上清。
( 3) 6%牛白蛋白。
【操作】
( 1)在13mm×100mm的试管中，加等体积洗涤后的压积红细胞和6%牛白蛋白，混匀。
( 2) 56℃，孵育10分钟。孵育期间，定时摇动试管。
( 3) ( 900～1000)×g离心2～3分钟。
( 4)立即转移上清放散液至一新试管，和红细胞末次洗涤的盐水上清平行试验。
【注意事项】
对于冷抗体，红细胞应用冷盐水洗涤，防止结合的抗体在放散前解离。
2.乙醚放散法 【试剂与器材】
( 1)受检者血清。
( 2)相应抗原的红细胞(抗凝血)。
( 3)乙醚(分析试剂)。
( 4) AB型血清。
【操作】
( 1)取具有相应抗原的抗凝血，离心后吸去血浆，加大量生理盐水，洗涤3次，离心，取压积红细胞备用。
( 2)将适量的受检者血清和压积红细胞混匀后，放在适当的温度中1小时，在此期间要摇匀1～2次。
( 3) ( 800～1000)×g离心5分钟，将上清液吸出另放1管，鉴定上清液中的抗体，以判断待检血清除被吸收的抗体外，是否还有其他血型抗体。
( 4)将红细胞用盐水洗涤3次，离心压积红细胞。
( 5)取1体积压积红细胞，加1体积AB型血清或生理盐水、2体积乙醚，用力颠倒振摇1分钟，然后以( 900～1000)×g离心3分钟。
( 6)离心后即分成3层，最上层是乙醚，中层是红细胞基质，下层是具有抗体的放散液，其色深红。
( 7)用清洁的吸管吸出放散液。若有混浊，可再离心1次。
( 8)将放散液放置37℃水浴中10分钟，除尽乙醚。
( 9) ( 900～1000)×g离心2分钟，取上层深红色放散液鉴定抗体。
【注意事项】
本试验适用于鉴定Rh抗体。最大优点用于检查获得性溶血性贫血，此类患者的红细胞为直接抗球蛋白试验阳性，说明在体内已有自身抗体吸附在红细胞上。这种抗体常常有Rh特异性。
五、血型抗体效价测定
【原理】
血型效价测定(又称效价滴定)是一种半定量方法，用来确定血清中抗体的浓度或比较红细胞表面抗原表达强度差异。血型抗体效价滴定常用于以下情况:发生胎母同种免疫时，检测孕妇体内抗体的活性;判断自身抗体特异性;鉴别高效价低亲合力抗体，Knops、Chido/Rodgers、Cs a、JMH抗体常表现此特性;观察巯基还原剂对抗体活性的影响，以判断免疫球蛋白的种类( IgG或IgM)。
【试剂与器材】
1.待滴定血清或血浆。
2.2%～5%表达相应抗原的红细胞生理盐水悬液。
3.生理盐水(也可用白蛋白作稀释液)。
【操作】
1.根据血清稀释度标记10支试管(比如1∶1、1∶2等)。1∶1代表1体积未稀释血清; 1∶2代表1体积血清被稀释至2体积或50%的血清稀释液。
2.除第1管(未稀释，1∶1)外，每支试管中加1体积盐水。
3.前两管(未稀释和1∶2)中，各加1体积血清。
4.用干净的吸管，混匀1∶2中的液体数次，转移1体积至下一支试管( 1∶4)。
5.重复相同的步骤，直至完成所有稀释，每次使用干净的吸管混匀并转移液体。从最后一管中吸出1体积稀释过的血清并留存，以备后续稀释使用。
6.按稀释度标记10支试管。
7.从每个稀释过的血清中转移2滴至对应标记的试管，每个稀释度使用一支独立的吸管。每管加2 滴2%红细胞悬液。也可加试剂商提供的3%～4%的红细胞悬液1滴，但这种方法不够精确。
8.充分混匀，根据抗体性质，用合适的血清学技术检测。
9.肉眼观察结果，打分并记录。前带效应可能会造成稀释度低的血清反应比稀释度高的血清弱。如果要避免结果误读，最好先观察稀释度最高的试管，依次判读，直至未稀释样本管。
【结果判定】
观察肉眼凝集1 +的最高稀释度。效价用稀释度的倒数表示(如32，而不是1/32或1∶32)。如果稀释度最高的血清仍有凝集，说明还未到达反应终点，应继续稀释并检测。
【注意事项】
1.在比较研究中，效价相差3个或3个以上稀释度，为显著差异。技术差异和生物固有的可变性会导致重复试验的结果升高或降低1个稀释度。比如，血清中抗体的真实效价为32，在重复试验中，终点可能出现在1∶32、1∶64或1∶16的试管中。
2.如果不评估凝集强度，效价值就会引起误解。可以给观察的凝集强度打分，滴定试验中所有试管的分数总和为最终分数，这是另一种测量抗体活性的半定量方法。不同的样品相差10分或以上，可以粗略地判定两者的分数有显著差异。
3.高效价低亲合力抗体的效价通常大于64，而且大部分试管表现出一致的弱反应。
4.大体积比小体积测量准确。同一组试验中，大量稀释得到的结果比每个实验分别稀释的结果更可靠。要计算所有试验需要的体积，每个稀释度都要准备足够的量。
5.移液很关键。推荐使用可更换吸头的移液器。
6.检测用红细胞的年龄、表型和浓度会影响结果。
7.孵育的最适时间和温度、离心的时间和转速都要保持一致。
8.如果要比较多个含抗体血清的效价，所用红细胞(最好新鲜采集)应来自同一献血者。如果没条件，应用来自相同表型献血者的混合试剂红细胞完成试验。样本只有同时做检测，比较才有效。
9.如果一份血清要和不同的红细胞样本反应，所有红细胞都应采用相同的采集和保存方法，并稀释到相同的浓度。所有试验都应来自同一份母液。样本只有同时做检测，比较才有效。
六、聚凝胺试验
【原理】
聚凝胺试验( polybrene)使用低离子介质( low ionic medium，LIM)加速IgG型抗体与红细胞之间的反应速度。聚凝胺作为一种碱性分子可以和红细胞表面的酸性糖分子结合，在离心力的作用下聚凝胺使红细胞相互靠近，使得已经结合在红细胞表面的IgG抗体分子可以在不同的红细胞之间搭桥。然后加入重悬液，使得聚凝胺的作用被消除。被聚凝胺凝集起来的红细胞，此时会渐渐散开，但已经被IgG抗体分子搭桥连接起来的红细胞不会散开，以此检测血清或血浆中存在的血型抗体。本试验具有敏感性高及快速等优点，已应用于血型检查、抗体筛选和鉴定、交叉配血试验。聚凝胺试剂目前国内市场有售。
【试剂与器材】
1.低离子介质( LIM)。
2. Polybrene试剂。
3.2%～5%已知抗原的红细胞生理盐水悬液。
4.重悬液。
【操作】
1.小试管中加入待检血清2滴和1滴2%～5%红细胞悬液。
2.立即以1000×g离心，观察结果。如果阴性则继续试验;如果阳性，需分析原因排除干扰后继续后续试验。
3.加0.6ml LIM试剂，室温放置1分钟。
4.加入2滴polybrene试剂，立即以1000×g离心1分钟，弃去试管中液体，轻摇试管，肉眼判断红细胞凝集情况。如果有凝集出现则继续操作。如果没有凝集出现则该试验无效。
5.加入1滴重悬液，轻摇试管，肉眼观察结果。
【结果判定】
1分钟内凝集消失为聚凝胺试验阴性，1分钟内凝集不消失为聚凝胺试验阳性。
【注意事项】
1.通常情况下，使用低离子强度溶液( LISS)法和LIM试剂作为缩短抗原-抗体的反应时间是同时有效的。
2.加入重悬液后，应尽快观察结果，以免弱反应消失。
3.肝素会中和聚凝胺的作用，应避免用肝素抗凝的血样。
4.聚凝胺方法不适合Kell系统抗体的检测，所以对阴性结果需进行抗球蛋白试验，以免漏检。黄种人中Kell系统抗体极罕见。