血浆等体液中的蛋白质种类众多，按化学结构可分为仅由氨基酸残基以肽键相连而成的单纯蛋白质和结合有多糖基、脂质、核酸、无机离子等的结合蛋白。由于至今尚无一种可对体液中各种类型蛋白质总量准确测定的常规方法技术，因此，临床检验对体液中总蛋白质( total protein，TP)测定时需假设:①所有体液蛋白均是单纯蛋白质，故其含氮量平均为16%，糖、脂和无机离子等均不计在内;②各种体液蛋白与化学试剂的反应性(成色、沉淀)均一致。基于以上2个假设，体液中总蛋白的测定方法一般利用下列5种单纯蛋白质特有的结构或性质。

利用肽键在碱性溶液中可与铜离子发生双缩脲反应，生成紫红色络合物的双缩脲法，为临床检验应用的主要方法。

如蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基可还原磷钨酸-磷钼酸试剂起蓝色反应的酚试剂法，芳香族氨基酸残基在280nm处有吸收峰的紫外分光光度法。

如在酸性环境下，蛋白质分子可解离出带有正电荷的NH ₃ ⁺，它可与氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等染料的阴离子结合，产生颜色反应的染料结合法。

如加入磺基水杨酸、三氯乙酸等蛋白沉淀剂后，蛋白质可产生细小的变性沉淀，混悬液的浊度或光折射的改变与蛋白质的浓度成正比的比浊法。

蛋白质经强酸高温消化后转化成铵盐，加碱使铵盐生成氨，经蒸馏分离，用酸滴定氨，以耗酸量推算氨及氨中含氮量，根据蛋白质平均含氮量为16%计算蛋白浓度的凯氏定氮法。该法结果准确性好，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。但操作复杂烦琐，不适合临床常规检测，多用于蛋白质定量标准品的定值。

上述前4类方法技术测定血清等体液中总蛋白时，都需要使用定标品。正常人混合血清经凯氏定氮法准确定值后，是各种常规血清总蛋白测定方法的最佳标准液。牛或人血清白蛋白配制的标准液适用于双缩脲法测定的校准，因为白蛋白为单纯蛋白质并有高纯度的商品试剂，其含氮量恒定，可用凯氏定氮法准确定值;并且其分子中肽键数已知，发生双缩脲反应的成色反应稳定。建议使用凯氏定氮法定值的正常人(具有正常的白/球蛋白比例)血清或混合血清作为染料结合法的定标。对于沉淀法的定标，因为磺基水杨酸对白蛋白产生的浊度比对球蛋白产生的浊度要大2.5倍，故牛或人血清白蛋白标准液都不适用于磺基水杨酸沉淀法，但可用于三氯乙酸沉淀法定标。

2个尿素(脲)分子缩合后生成的双缩脲( H ₂N—OC—NH—CO—NH ₂)，在碱性溶液中可与Cu ^{2 +}络合生成紫红色反应物，称双缩脲反应。所有蛋白质中都含有肽键，含有2个以上肽键(—CONH—)的肽、蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中亦可与Cu ^{2 +}发生类似双缩脲反应，生成紫红色的络合物。紫红色络合物在540nm的吸光度与肽键数量呈正比关系，据此可计算总蛋白质含量。产生双缩脲反应的试剂称双缩脲试剂。

使用新开瓶的优质氢氧化钠，以减少碳酸盐的污染。称取240g NaOH溶于约800ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，再加水定容至1L。置聚乙烯塑料瓶中，密塞(不能用玻璃塞)室温中保存。

称取3.00g未风化、没有丢失结晶水的CuSO ₄·5H ₂O，溶解于500ml新制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钠钾( KNaC ₄H ₄O ₆·4H ₂O) 9.00g和KI 5.0g。待完全溶解后，加入6.0mol/L NaOH溶液100ml，用蒸馏水定容至1L，置聚乙烯塑料瓶中，密塞(不能用玻璃塞)放室温中保存，至少可稳定6个月。该试剂在波长540nm的吸光度必须在0.095～0.105，否则要重新配制。

不含硫酸铜，其他成分和双缩脲试剂相同。

可用正常人混合血清，经凯氏定氮法测定总蛋白浓度。最方便的是购买有批准文号的优质市售试剂盒。

按表2-1-1操作。

混匀，37℃反应10分钟，分光光度计波长540nm、比色杯光径1.0cm用空白管调零，读取标准管和各测定管的吸光度。

不同厂家试剂盒及自动生化分析仪的参数设置可能不同，应坚持选用有正式批文，可量值溯源至参考物质NIST SRM927c的质量可靠的产品，严格按说明书及本科室的SOP文件操作。下面以某试剂盒的有关上机参数设置为例。

单试剂(双缩脲试剂)。

测定模式:单试剂终点法;反应模式:吸光度增加型;定标方式:两点定标;反应温度: 37℃;主波长: 546nm;次波长: 700nm;试剂: 300μl;血清/标准液6μl;混合后读取吸光度为A ₁;反应时间: 600s后读取吸光度为A ₂。

( 1)方法学特点:该法对各种蛋白质呈色基本相同、显色稳定，特异性、准确度和精密度好，试剂单一、方法简便。本法灵敏度较低(最低检测限2g/L，线性范围10～150g/L)，但可满足血清总蛋白定量要求，而对蛋白质含量低的脑脊液、胸腹水和尿液等其他体液总蛋白定量时不宜采用。以血浆为标本时，因血浆中含有大量的纤维蛋白原，不宜用血清的参考区间。当血清存在脂浊(或静脉输注右旋糖酐使测定管混浊)、溶血(血红蛋白＞650mg/dl)、严重黄疸(胆红素在540nm有弱吸光度)时，对本法有干扰。检测此类血清标本，应设血清0.1ml加双缩脲空白试剂5.0ml的标本空白管，用双缩脲空白试剂调零，检测标本空白管吸光度。以测定管吸光度减去标本空白管吸光度后的净吸光度，作为计算总蛋白浓度的测定管吸光度。若标本空白管吸光度过高，仍会影响测定的准确度。

( 2)双缩脲试剂中各成分的作用:①碱性酒石酸钠钾的作用是与Cu ^{2 +}形成复合物，并维持复合物的溶解性，保证与肽键充分反应;②碘化物是抗氧化剂，避免Cu ^{2 +}被氧化;③Cu ^{2 +}在碱性环境中与酒石酸钠钾形成的复合物可与肽键的羰基氧和酰氨基氮生成紫红色络合物。

( 3)报告单位:因血清中各种蛋白质的相对分子质量不同，所以血清总蛋白质浓度只能用g/L表示，不能用mol/L。

( 4)吸光度的大小与试剂的组分、pH、反应温度有关:若能保证上述条件在稳定的标准化状态，可以不必每次做标准管，而依据比吸光度法计算蛋白质浓度;或者配制系列浓度蛋白标准液，绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算样本的蛋白质浓度。

( 5)酚酞、磺溴酞钠在碱性溶液中呈色，影响双缩脲的测定结果，但人血清中不存在这些物质，可不考虑。此外，含有2个以上肽键的肽、蛋白质分子中的肽键才能发生双缩脲反应，并且随着肽键增加呈色由粉红色到红紫色。但血清等体液中二肽及三肽等寡肽极微量，对总蛋白量的影响也可忽略不计。

( 6)采血状态对结果的影响:应在安静状态下仰卧位采血，因直立体位总蛋白浓度可有10%升高，特别是进行性水肿患者更明显;剧烈运动后立即采血总蛋白最多可升高12%;采血时止血带压迫静脉时间超过3分钟，总蛋白也可上升10%，应避免。

( 7)标本稳定性:密闭血清标本室温保存1周、2～4℃保存1个月不影响测定结果。冷冻标本室温解融后必须充分混匀再测定。

严格按照Doumas方法所规定的配方配制双缩脲试剂、控制反应条件和校准分光光度计的情况下，蛋白质肽键的双缩脲反应呈色强度稳定，可以根据蛋白质双缩脲络合物的比吸光度，直接计算血清总蛋白浓度。

同双缩脲法。

按表2-1-2操作。

各管迅速充分混匀后，置( 25±1)℃水浴中保温30分钟。立即用经过校准的高级分光光度计，在波长540nm，1.0cm光径比色杯，读取各管吸光度。读“测定管”及“试剂空白管”吸光度时，用蒸馏水调零;读“标本空白管”吸光度时，用双缩脲空白试剂调零。

式中A _t为测定管吸光度，A _r为试剂空白管吸光度，A _s为标本空白管吸光度。

如测定所用的分光光度计波长准确，带宽≤2nm、比色杯光径为准确的1.0cm时，血清总蛋白含量可根据比吸光度用下式直接计算:

式中0.298为蛋白质双缩脲络合物的比吸光系数，即按Doumas双缩脲试剂标准配方，在上述规定的反应及测定条件下，蛋白质浓度为1.0g/L时的吸光度。

检查比色杯的实际光径可按下述方法进行。

1.每升含43.00g硫酸钴铵六水合物［( NH ₄) ₂ Co ( SO ₄) ₂·6H ₂O］的水溶液，在比色杯光径1.0cm、波长510nm时，吸光度应为0.556。

2.每升含0.050g重铬酸钾的水溶液(加数滴浓硫酸)在比色杯光径1.0cm、波长350nm时，吸光度应为0.535。

如测出的吸光度与上述不符，表示比色杯光径非1.0cm，计算结果时需进行校正。校正系数F = A _s/ A _m。A _s为钴盐的吸光度( 0.556)或重铬酸钾的吸光度( 0.535)，A _m为实测的吸光度。 F还可取两种溶液校正系数的均值。用下式计算:

因基本原理同“双缩脲常规法”，请参见该法注意事项。

由于本法的定量基础为比吸光度，因此，除准确配制试剂，严格控制反应条件外，对分光光度计的性能，包括波长、带宽，以及比色杯的光径、清洁等，必须保证在良好状态，并定期校正。否则会严重影响测定结果准确性。

成人血清总蛋白浓度(双缩脲常规法) : 65～85g/L。

上述参考区间引自WS/T 404.2—2012《临床常用生化检验项目参考区间》。

1.血浆中水丢失而浓缩，总蛋白浓度相对增高呕吐、腹泻、高热大汗等急性失水时，可升高达100～150g/L;使用脱水、利尿药，以及休克、慢性肾上腺皮质功能减退患者，亦可出现血浆浓缩。

2.血清蛋白质合成增加　多见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症患者，此时主要是球蛋白增加，总蛋白可＞100g/L。

如各种原因所致水潴留，总蛋白浓度相对降低。

长期食物中蛋白不足或慢性肠道疾病所致的吸收不良，体内蛋白质合成原料缺乏;严重结核病、甲状腺功能亢进、长期发热和恶性肿瘤等均可致血浆蛋白大量消耗。

主要是严重肝功能损伤致蛋白质合成减少，以白蛋白下降最显著。

肾病综合征时大量蛋白特别是白蛋白从尿中丢失;严重烧伤时大量血浆渗出;大出血、溃疡性结肠炎等均可使蛋白丢失。