上QQ阅读APP看书,第一时间看更新
第八节 胎儿新生儿溶血病的血型血清学检查
胎儿新生儿溶血病( hemolytic disease of the fetus newborn,HDFN)是由母婴血型不合引起的,是由于母亲体内具有针对婴儿体内遗传自父亲红细胞抗原的抗体,从而导致的胎儿和新生儿红细胞的破坏而引起的。母亲体内的IgG类抗体,可以通过胎盘进入胎儿的血液循环,结合到相应的红细胞抗原上,使得包被了抗体的红细胞在胎儿脾脏内被巨噬细胞破坏。除了针对ABO及Rh抗原之外,针对其他抗原的抗体也会导致HDN。其他被报道会引起轻度的或严重的HDFN的抗体,还有抗M,抗Kpa,抗Kpb,抗Ku,抗Jsa,抗Jsb,抗Jka,抗Fya,抗Fyb,抗S,抗s以及抗U等。诊断HDN最有力的证据是证实患儿红细胞被来自母亲的IgG抗体所致敏,所以要首先对患儿的红细胞进行直接抗球蛋白试验检测。但由于ABO-HDFN患儿红细胞上ABO抗原发育不完全,再加上血浆中所存在的可溶性A和(或) B血型物质可中和部分IgG抗A和(或)抗B,所以ABO-HDFN的症状通常不是很严重。无论是为了检测是ABO-HDN还是Rh-HDN,均要进行母亲及新生儿的血型鉴定及母亲的抗体筛查,以便进行进一步的实验分析。
一、ABO新生儿溶血病血型血清学检查
ABO胎儿新生儿溶血病( HDFN)是由于母体的IgG抗A ( B)经胎盘侵入胎儿循环,致敏并破坏胎儿红细胞。因为母亲在怀孕血型不合的胎儿以前就可能有高效价的IgG抗A ( B),所以ABO-HDFN有约50%发生在第一胎。
O型母亲血清中IgG抗A ( B)效价较高,所以,ABO-HDFN患儿的母亲往往多数是O型。又因为胎儿红细胞上的A位点(抗原决定簇)较B位点为多,故发生ABO-HDFN的以A型婴儿比B型婴儿为多。仅少数ABO-HDFN发生于母子血型为(母血型-子血型) : O-B,A-AB,B-A或B-AB。
夫妇或母子的ABO血型配合和不配合的判定见表1-5-6。
(一)患儿及其父母的ABO血型鉴定
ABO血型的鉴定方法参考本章第一节ABO血型鉴定。
由于新生儿免疫系统发育尚未健全,因此新生儿ABO定型时只做正定型,而不做反定型。又由于新生儿红细胞膜上ABO抗原发育尚不充分(约成人抗原数量的五分之一),因此在新生儿ABO正定型时,应注意有可能存在的弱反应。
婴儿及其父母ABO血型的鉴定是检查新生儿溶血病的第一步,以便考虑以后进一步检查的程序。
表1-5-6 夫妇或母子间ABO血型关系
(二)母亲血清中IgG抗A ( B)检查 【原理】
ABO-HDFN由于IgG抗A ( B)引起,当母亲血清中IgG抗A ( B)效价≥64时,提示其血型不合胎儿有可能发生ABO HDFN。所以检测母亲血清中有无IgG性质的抗体并测定其效价,即可预计ABO-HDN发生的可能性。
人血清中的抗A、抗B往往是IgM和IgG混合物,它们具有相同的特异性,要单独测定IgG抗A ( B)必须去除IgM抗A ( B)的干扰。一般先用巯基乙醇( 2-Me)处理血清,破坏IgM抗A ( B),再进行IgG抗A和抗B的检测。
【试剂】
( 1) 2%~5%红细胞悬液( A型和B型)。
( 2)抗人球蛋白试剂。
【操作】
1.吸取受检者血清,加等量2-Me应用液并混合均匀,使用封口膜将试管口封住,室温放置30分钟或37℃水浴10分钟。
2.排列小试管( 10mm×60mm)两排,每排10支,从第1排第2管开始每管各加生理盐水100μl。
3.第1管加2-Me处理血清100μl,第2管同样加入100μl 2-Me处理血清并混合均匀,吸出100μl,移至第3管内。以此类推,作倍比稀释至第10管,最后一管混匀后,吸出100μl丢弃。每管内留有1∶2,1∶4,…,1∶1024不同稀释度血清各100μl。
4.将第1排中倍比稀释的处理后血清各取50μl,加入相应的第2排各管中。
5.第1排每管各加2%~5% A型红细胞悬液50μl,第2排每管各加2%~5% B型红细胞悬液50μl,置37℃水浴温育30分钟。
6.3400r/min[( 900~1000)×g]离心15秒,结果观察,如在发现有红细胞凝集,记录第一次出现凝集度为±的效价。
7.将各管红细胞用生理盐水洗涤3次,扣干残留液体。
8.每管加入抗人球蛋白血清1滴,混合。3400r/ min[( 900~1000)×g]离心15秒。
9.轻轻摇动试管,从低稀释倍数管(第一管)开始观察结果,第一次出现凝集度为±的试管,其稀释倍数即为IgG抗A ( B)的效价。
【注意事项】
1. IgG抗A ( B)效价测定,第1管的血清已经使用等体积的2-Me破坏,故已经稀释一倍,所以效价起始为2。
2.母亲血清IgG抗A ( B)抗人球蛋白介质凝集效价≥盐水介质凝集效价两管( 4倍)时,可以认为抗球蛋白介质凝集效价即为IgG抗体效价。
(三)患儿血样检查 【原理】
母亲血液中的IgG类抗体可以通过血胎屏障进入胎儿体内,这些抗体会游离分布在胎儿的血液中,也会结合在胎儿的红细胞上。所以,要对胎儿血样进行抗体的检测,来判定HDFN是否是相应的抗体导致产生。
【试剂】
1.患儿血样。
2. ABO试剂红细胞,酶处理ABO试剂红细胞。
3.多特异性抗人球蛋白试剂。
【操作】 1.患儿红细胞直接抗球蛋白试验
( 1)将患儿红细胞用盐水洗涤3次,配成2%~5%红细胞盐水悬液。
( 2)取小试管2支,各加入患儿红细胞悬液1滴,然后,一管加入多特异性抗人球蛋白试剂1滴,另一管加盐水1滴,混合后立即以3400r/min ( 1000×g)离心15秒。
( 3)轻轻转动试管,观察结果。
2.患儿红细胞抗体放散试验
致敏的患儿红细胞通过加热放散试验将抗体放散于放散液中,然后再加入酶处理的成人相应红细胞致敏,红细胞先经酶处理可增强吸收抗体的能力。经充分洗涤后,用抗人球蛋白血清来促使凝集反应的发生。此法甚敏感,即使DAT阴性,放散试验也有可能得到阳性的结果。方法如下:
( 1)取患儿不抗凝(或干粉抗凝)血样,用搅拌棒捣碎血块并用盐水洗涤3次,取压积红细胞1ml左右,加等量盐水,置大试管中。
( 2)将试管放在56℃水浴中不断振摇1分钟后放置于56℃水浴箱中9分钟,取出后立即以3400r/ min ( 1000×g)离心1分钟,吸取上层液(即放散液)备用。
( 3)将放散液分为3份,加入3个小试管中,分别加入3% A、B及O型酶处理红细胞盐水悬液1滴,37℃致敏30分钟。
( 4)取出后,用盐水洗3次,加入多特异性抗人球蛋白试剂1滴,以3400r/min ( 1000×g)离心15秒,肉眼观察,按表1-5-7判断。
表1-5-7 患儿红细胞抗体放散试验的意义
在放散试验的结果观察中,会遇到一种交叉反应性抗体,这是O型人血清中除抗A、抗B以外的第三种抗体抗AB。它针对的特异性是A和B抗原所共有的,因而它能凝集A型和B型红细胞。
3.患儿血清中游离抗体测定
新生儿血清中的IgG抗A ( B)来自母亲,因此,如果在新生儿血清中发现有与其红细胞不配合的IgG抗A ( -B)时,表明婴儿可能为ABO抗体引起的HDFN。方法如下:
( 1)取小试管3支,每管加患儿血清2滴。
( 2)分别加入3%A、B、O型红细胞盐水悬液1滴,37℃水浴致敏30分钟后取出,用盐水洗3次后,加入抗人球蛋白血清1滴,3400r/min离心15秒后,肉眼观察结果。按表1-5-8分析结果。
表1-5-8 新生儿血清中游离抗体检查
4.患儿血清胆红素测定 【原理】
当母亲的抗体结合到胎儿的红细胞抗原上时,会造成胎儿红细胞通过Fc受体黏附到其脾脏内的巨噬细胞上,导致溶血产生。溶血的发生率以及严重程度与IgG抗体的亚类、抗体数量以及红细胞上的抗原数目有关。IgG1与IgG3比IgG2和IgG4更容易导致溶血的发生。IgG1与IgG3在怀孕第6个月开始,便通过Fc受体转运通过胎盘直至分娩。由于IgG1通过胎盘的时间早于IgG3,而且数量巨大,所以常常会导致比较严重的溶血。
【操作】
作患儿血清胆红素测定,采用胆红素单项自动测定仪进行测定。
【结果判定】
一般认为在正常情况下,足月新生儿脐血胆红素24小时<102μmol/L,即<6mg/dl; 48小时<128μmol/L,即<7.5mg/dl; 3~7天<205μmol/L,即<12mg/dl。未成熟新生儿24小时<136μmol/L,即<8mg/dl; 48小时<205μmol/L,即<12mg/dl; 3~7天<256μmol/L,即<15mg/dl。超过这个范围作为病理性黄疸考虑。
【注意事项】
1.患儿红细胞加盐水管应不凝集,若这管发生凝集,说明细胞本身有自凝现象,试验结果无参考意义。
2.若患儿红细胞直抗为阴性,要使用IgG致敏红细胞与抗球蛋白试剂建立阳性对照,以确定结果的可靠性。
二、Rh新生儿溶血病血型血清学检查
我国汉族人Rh新生儿溶血病由抗D (包括D、DE、CD、cD)引起者约占61.5%;由抗E (包括E、cE)引起者约占34.4%。本病绝大多数发生于第2胎,少数见于曾有输血史的第1胎。如因某原因而导致曾经发生过流产,再次怀胎时亦可发生。
(一)产妇的血清学检查 【原理】
当经产或因输血而产生抗体的妇女,在以后怀Rh阳性胎儿时,抗体会通过胎盘进入胎儿体内,导致严重的新生儿溶血病的发生。
【试剂】
1.产妇血样。
2.谱细胞,抗人球蛋白试剂。
【操作】
1.产妇血清抗体筛选试验产妇血清2滴加筛选细胞1滴,混匀后立即离心以检测产妇是否含有IgM类不规则抗体。若结果为阳性,则需要使用2-Me破坏IgM类抗体之后,再进行间接抗球蛋白试验;若结果为阴性,则将试管置37℃孵育30分钟,然用盐水洗3次后,加入抗人球蛋白试剂1滴,3400r/min [( 900~1000)×g]离心15秒,观察结果(详见本章第五节中IgG血型同种抗体筛选试验)。
2.谱细胞对产妇血清进行特异性分析若被检血样抗体筛选试验结果阳性,则需使用谱细胞对产妇血清进行特异性分析,以判断是否存在Rh抗体(详见本章第六节红细胞血型抗体鉴定)。
3. Rh抗体效价测定当产妇血清中检出某种Rh抗体时,应选择纯合表达此抗体针对抗原的红细胞,进一步测定其效价。如需在不同时间内测定产妇抗体时,必须选用抗原表达量相近的红细胞和相同的方法,以做比较。如Rh抗体效价≥256,则其血型不合胎儿可能严重受害,效价在≤16者,一般其血型不合胎儿的溶血病一般较轻。
孕妇分娩前后血清学检查见表1-5-9。
表1-5-9 孕妇分娩前后血清学检查计划
(二)婴儿的血清学检查 1.直接抗球蛋白试验
直接抗球蛋白试验的操作与判读方法详见本章第四节。由于严重的Rh-HDFN患儿红细胞常致敏有大量IgG同种血型抗体(如抗D),因此在进行直接抗球蛋白试验时常呈强阳性。而这时如果用IgM抗体来检查患儿的Rh血型,可能得假阴性结果,称为遮断现象。这是因为患儿红细胞上的抗原已被IgG抗体占据,不能再与相应的IgM抗体结合的关系。
2.放散与抗体鉴定试验 【原理】
致敏在红细胞上的IgG血型抗体可以通过乙醚将结合有膜蛋白上的抗体解离至放散液中,然后再通过对含抗体的放散液进行抗体鉴定,分析致敏在新生儿红细胞膜上抗体的特异性。
【试剂】
( 1)乙醚。
( 2)谱细胞。
( 3)抗人球蛋白试剂。
【操作】
1.取患儿不抗凝(或干粉抗凝)血样,用搅拌棒捣碎红细胞并用盐水洗涤3次,加等量盐水,置大试管中。
2.加入两倍体积乙醚,振荡1~2分钟,3400转/分( 1000×g)离心3分钟。
3.吸出下层深色放散液,转入另一管中,37℃放置10分钟以挥发残余乙醚。
4.3400r/min ( 1000×g)离心3分钟,取深色上清,即为红细胞放散液。
5.平均分配放散液,使用谱细胞对患儿放散液以抗球蛋白试验方法,进行抗体鉴定。
【结果判定】
根据放散液与谱细胞反应的结果,与谱细胞供应商提供的反应格局进行比对,来判定抗体的特异性(详见本章第六节 红细胞血型抗体鉴定)。
1.游离抗体检查
患儿血清与谱细胞以间接抗人球蛋白试验的方法测定其血清中是否含有血型同种抗体(详见本章第六节 红细胞血型抗体鉴定)。
2.血清胆红素定量
见本章第八节中ABO新生儿溶血病患儿血样检查。Rh-HDFN黄疸出现的时间一般较ABO-HDFN为早,且血清胆红素的浓度也较高。
【注意事项】
1.标本的送验时间与要求
( 1)由于Rh新生儿溶血病患者的游离胆红素在出生后会急剧上升,因此尽早诊断是治疗方案确定的关键。产前血型抗体检查可及时预判严重的Rh新生儿溶血病。产后患儿血样的及时送检以及产妇和丈夫的血样同时送检也有助于及时判定造成溶血的抗体特异性。
( 2)新生儿脐带血与新生儿静脉血在检测时同样有效。新生儿血样在运输过程中应注意避光。
2.新生儿溶血病血清学检查程序 参见图1-5-4。
3.在同一次妊娠过程中,连续监测母源性抗体效价升高的情况是有意义的。冻存血清或血浆在复溶后效价会降低。
4.孕妇血清或血浆中抗体效价的高低并不完全反映胎儿红细胞破坏的程度,胎儿或新生儿的溶血程度还与抗体的亚类和吞噬系统的活性相关。
图1-5-4 新生儿溶血病血清学检查程序
注: *经巯基乙醇处理,破坏完全抗体后,再检查不完全抗体