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第二节 造血原料缺乏性贫血的检验
血红蛋白由珠蛋白和亚铁( Fe 2 +)血红素组成。珠蛋白由两条α链与两条非α链组成，表型分析已在本章第一节讨论;亚铁血红素是血红蛋白的辅基，由亚铁原子和原卟啉Ⅸ组成。体内的铁以多种形式保持着铁代谢的动态平衡，还有许多物质如红细胞内游离原卟啉、红细胞生成素、叶酸和维生素B 12作为重要的造血原料和造血因子参与了骨髓红系细胞分化、增殖和成熟过程。若这些物质在体内减少或利用障碍，便可表现为红细胞生成减少性贫血。
一、红细胞原卟啉和铁元素相关的检验
(一)红细胞内游离原卟啉测定 【原理】
用加酸的醋酸乙酯或无水乙醇破坏红细胞并提取红细胞内游离原卟啉( free erythrocyte protoporphyrin，FEP)。卟啉在紫外线照射下会发荧光，可用荧光比色法加以测定。
【试剂】 1.酸化无水乙醇
无水乙醇94ml，加入2.5mmol/L HCl至100ml。
2.标准原卟啉Ⅸ原液( 5mg/L)
精确称取原卟啉Ⅸ粉剂5mg，加少量酸化无水乙醇溶解后至1000ml，盛于棕色瓶中，外用黑纸包裹，贮存于4℃冰箱中，可用一个月。
3.标准原卟啉Ⅸ工作液( 50μg/L)
上述贮存原液以酸化无水乙醇稀释100倍，临用前新鲜配制。
【操作】
按表1-3-11进行操作。
表1-3-11 红细胞内游离原卟啉测定步骤
置旋涡式振荡器上振荡2～3分钟，以3000r/min离心6分钟，将上清液倒入荧光比色杯中，于荧光光度计上进行荧光度测定(激发滤片400nm，发射滤片600nm)。以空白管校零点，标准管校荧光强度并调至100，读取测定管的荧光强度读数( Fu)。另用肝素抗凝全血测血细胞比容( PCV)。
【结果计算】
【参考区间】
成人: ( 398.4±131.7)μg/L RBC。
【临床意义】
因铁缺乏致血红蛋白合成减少，造成红细胞内FEP增多。铅中毒、红细胞生成性卟啉病、MDS等病时FEP也升高。恶性贫血，营养性巨幼细胞贫血及红白血病时游离原卟啉较低。
【注意事项】
1.原卟啉在强光下易破坏，取得标本后尽快测定。如血液标本收集后不能立即测定，应保存在暗处或冰箱( 4℃)中，但不得超过24小时。操作过程应在避光条件下进行。
2.荧光强度在2小时内基本稳定，随着时间的延长而逐渐衰退。
3.各实验室宜验证参考区间。国内有些单位采用血液荧光测定仪测定血液中红细胞内锌原卟啉( zinc protoporphyrin，ZPP)含量，协助慢性铅中毒或缺铁性贫血的诊断。这是用于普查的筛检方法，测定时应严格按照使用说明书操作。一般用ZPP＞3.5μg/g Hb作为缺铁性贫血诊断指标之一。
(二)血清铁测定 【原理】
血清铁( serum iron，SI)以Fe 3 +形式与转铁蛋白( transferrin，Tf)结合存在，降低介质pH及加入还原剂(如抗坏血酸、羟胺盐酸盐等)能将Fe 3 +还原为Fe 2 +，则转铁蛋白对铁离子的亲和力降低而解离，解离出的Fe 2 +与显色剂(如亚铁嗪或α，α'-联吡啶等)反应，生成有色络合物，同时作标准对照，计算出血清铁的含量。
【试剂】 1.甘氨酸/盐酸缓冲液( pH 2.8)
0.4mol/L甘氨酸溶液58ml、0.4mol/L盐酸溶液42ml和Triton X-100 3ml混合后加入无水亚硫酸钠800mg，使溶解。
2.亚铁嗪显色液
亚铁嗪0.6g溶于100ml去离子水中。
3.铁标准贮存液( 1ml =100μg Fe)
精确称取优级硫酸高铁铵［NH 4Fe ( SO 4) 2·12H 2O］0.8635g，置1L容量瓶中，加去离子水50ml，逐滴加入浓硫酸5ml，溶解后用去离子水补足至刻度，置棕色瓶中可长期保存。
4.铁标准应用液( 200μg/dl或35.8μmol/L Fe)
在100ml容量瓶中加入铁标准贮存液2ml，加适量去离子水后，再加浓硫酸0.5ml，最后用去离子水补足至刻度。
【操作】
1.采集血液3ml，以3000r/min离心10分钟，尽快分离血清。
2.取试管3支标明测定、标准和空白管，分别加入血清、铁标准应用液和去离子水各0.45ml，在上述各管中加入甘氨酸/盐酸缓冲液1.20ml，混匀。
3.在562 nm波长，5mm光径比色杯，以空白管调零，比色读取测定管吸光度(称血清空白)。
4.各管加入亚铁嗪显色液0.05ml，充分混匀，置室温15分钟，或37℃10分钟，再次读取各管的吸光度。
【结果计算】
【参考区间】
成年男性11.6～31.3μmol/L，女性9.0～30.4μmol/L。
【临床意义】 1.血清铁降低
常见于缺铁性贫血、慢性长期失血、恶性肿瘤和感染等。其中慢性长期失血占缺铁原因的首位，如月经过多、消化道失血、钩虫病、反复鼻出血、痔疮出血等。
2.血清铁增高
见于红细胞破坏增多时，如溶血性贫血;红细胞的再生或成熟障碍，如再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血。
【注意事项】
1.血清铁有明显的昼夜规律，上午高于下午，晚上则更低，其波动范围可达20%～30%。因此监测血清铁，尤其是观察疗效时，应注意标本采样时间一致。
2.血清本身的色度可干扰检测，检测时应做空白对照;溶血标本、严重脂血标本以及使用肝素钠抗凝血浆的标本会影响测定结果。
3.所用的玻璃器材必须用10% ( V/V)盐酸浸泡24小时，取出后再用去离子冲洗后方可应用，并避免与铁器接触，以防止污染。
(三)血清总铁结合力测定 【原理】
通常情况下，仅约有1/3的Tf与铁结合。在血清中加入已知过量的铁标准液，使血清中全部的Tf与铁结合达到饱和状态，再用吸附剂(轻质碳酸镁)除去多余的铁。再测定被吸附后铁的含量，其结果为血清总铁结合力( total iron binding capacity，TIBC)。用TIBC减去直接测得的SI，即为未饱和铁结合力( unsaturated iron binding capacity，UIBC)。SI与TIBC的百分比为铁饱和度。
【试剂】
1. TIBC铁标准液( 1000μg/dl或179μmol/L Fe) 在100ml容量瓶中，准确加入铁标准贮存液10ml，加适量去离子水后，再加入浓硫酸0.5ml，最后用去离子水补足至刻度。
2.轻质碳酸镁粉。
其他试剂见“血清铁测定”。
【操作】
1.于一具有塞子的试管中加入血清0.45ml、TIBC铁标准液( 1000μg/dl) 0.25ml和去离子水0.2ml，混匀。
2.放置室温10分钟后，加碳酸镁粉末20mg，振摇数次，再放置10分钟，其间再振摇数次，2500r/min离心10分钟。
3.取3支试管，标明测定、标准与空白管，分别加入上述离心上清液、铁标准液( 200μg/dl)和去离子水各0.45ml，向各管加入甘氨酸/盐酸缓冲液1.20ml，混匀。
4.在562nm波长，5mm光径比色杯，以空白管调零，比色读取测定管吸光度(称血清空白)。
5.向上述各管加入亚铁嗪显色液0.05ml，充分混匀，置室温15分钟或37℃10分钟，以空白管调零，再次读取各管的吸光度。
【结果计算】
【参考区间】 1. TIBC
男性50～77μmol/L，女性54～77μmol/L。
2. UIBC
25.1～51.9μmol/L。
3.铁饱和度
20%～55%。
【临床意义】
1.血清总铁结合力增高 见于缺铁性贫血、红细胞增多症、急性肝炎等。
2.血清总铁结合力降低 见于肝硬化、恶性肿瘤、溶血性贫血、慢性感染、肾病综合征、尿毒症和血色沉着症等。
3.血清铁、TIBC与铁饱和度等3项试验的综合分析的临床意义，见表1-3-12。
表1-3-12 3项试验综合分析的临床意义
注: N正常;↓降低;↑增高
【注意事项】
1.血清铁测定注意事项适于总铁结合力测定。
2.测定TIBC的常用方法多采用碳酸镁、氧化铝等吸附剂吸附多余的未结合的铁，经离心去除吸附剂再显色测定。这些方法标本用量大，前处理操作烦琐，影响结果的因素较多，随机误差较大。
3.在生化分析仪上采用Ferene法直接测定SI、UIBC计算总铁结合力，避免了前处理过程中人为的影响因素。
(四)血清铁蛋白测定 【原理】
血清铁蛋白测定可采用电化学发光免疫(双抗体夹心)法:将标本、生物素化的抗铁蛋白单克隆抗体和钌( Ru)标记的抗铁蛋白单克隆抗体混匀，形成夹心复合物;加入链霉亲和素包被的磁性微粒，使所形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上;微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去;电极加电压后触发三丙胺-三联吡啶钌反应系统，产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。
【操作方法及结果计算】
严格按试剂盒说明书进行。
【参考区间】
男性(年龄20～60岁) : 30～400ng/ml;女性(年龄17～60岁) : 13～150ng/ml。
【临床意义】 1.减低
血清铁蛋白( serum ferritin，SF)含量也能准确反映体内贮铁情况，与骨髓铁染色结果有良好的相关性。SF的减少是诊断缺铁性贫血的敏感方法之一。缺铁性贫血时SF＜14μg/L (女性＜10μg/ L)。降低亦可见于失血、慢性贫血等。
2.增高
见于肝脏疾病、血色病、输血引起的铁负荷过度，急性感染，以及铁粒幼细胞贫血患者。恶性肿瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌、白血病及淋巴瘤患者中部分病例血清铁蛋白可明显增高，其SF浓度与贮铁无关，与肿瘤细胞的合成和释放增加有关。
【注意事项】
1.接受过小鼠单抗治疗或体内诊治的患者可能会出现假阳性反应。
2.标本不能使用叠氮钠防腐。标本放置时间过长或处理不当、标本灭活或有沉淀时、试剂超过使用期限/或仪器性能下降等可对检测造成影响。
(五)血清转铁蛋白测定 【原理】
血清转铁蛋白( transferrin，Tf)测定采用免疫散射比浊法:利用抗人转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原-抗体复合物，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，可计算出转铁蛋白含量。
【操作方法及结果计算】
严格按试剂盒说明书进行。
【参考区间】
28.6～51.9μmol/L。
【临床意义】 1.增高
见于缺铁性贫血和妊娠。
2.降低
常见于肾病综合征、肝硬化、恶性肿瘤、炎症等。
【注意事项】
1.妊娠及口服避孕药或雌激素注射可使Tf升高。
2.标本放置时间过长或处理不当，脂血，标本有沉淀，或灭活过的标本，试剂超过使用期限/或仪器性能下降时可对检测造成影响。
(六)血清转铁蛋白受体测定 【原理】
血清转铁蛋白受体( serum transferrin receptor，sTfR)测定可采用酶联免疫双抗体夹心法。包被TfR特异的多克隆抗体，与血清中转铁蛋白受体进行反应，再加入酶标记的TfR抗体，使之形成“夹心”复合物，洗去游离的酶标抗体;加入底物和显色剂，其颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正比。
【操作方法及结果计算】
严格按试剂盒说明书进行。
【参考区间】
成人: 1.3～3.3mg/L。
【临床意义】
1.升高 常见于缺铁性贫血和溶血性贫血。一般采用血清可溶性转铁蛋白受体( sTfR)浓度＞8mg/L作为缺铁性红细胞生成的指标。对缺铁性贫血和慢性炎症的小细胞性贫血有鉴别价值。
2.降低 见于再生障碍性贫血、慢性病贫血、肾衰竭等。
3.用于临床观察骨髓增生状况和治疗反应。如肿瘤化疗后骨髓受抑制和恢复情况，骨髓移植后的骨髓重建情况，以及用红细胞生成素治疗各类贫血过程中的疗效观察和剂量调整等。
【注意事项】
1.新生儿、儿童sTfR高于成年人，随着年龄增长sTfR逐渐下降接近成年人;不同海拔高度的人群，sTfR浓度也不同，生活的海拔越高，sTfR浓度也越高;此外，孕妇随妊娠期的进展，sTfR不断升高，于产后5～10周恢复正常。
2.标本处理和保存不当时(如溶血、高血脂等)，可影响检测结果。
二、叶酸和维生素B12的测定
(一)血清和红细胞叶酸测定 【原理】
化学发光法采用竞争结合的原理。血清和溶血液经预处理后可将叶酸游离出来，添加叶酸结合蛋白、鼠抗叶酸结合蛋白、叶酸-碱性磷酸酶复合物以及包被的羊抗鼠捕获抗体的顺磁性颗粒到反应容器中，在标本中的叶酸与叶酸-碱性磷酸酶复合物竞争在叶酸结合蛋白的结合位点。通过鼠抗叶酸结合蛋白结合到固相上。在反应容器中孵育后，结合到固相上的材料固定在磁场，未结合的物质被洗去。随后将添加化学发光底物，并对反应产生的光量子进行测量，其与在叶酸中的浓度成反比。
【操作方法及结果计算】
严格按试剂盒说明书进行。
【参考区间】
血清叶酸＞11.81nmol/L;红细胞叶酸＞537nmol/L。
【临床意义】
叶酸减低有助于诊断由于叶酸缺乏引起的巨幼细胞贫血( megalo-blastic anemia，MgA) ;体内组织叶酸缺乏但当未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对判断叶酸缺乏尤其有价值。此外，可见于红细胞过度增生，叶酸利用增加，如溶血性贫血、骨髓增殖性肿瘤等。
【注意事项】
1.血清中的叶酸测定应禁食8小时后采样，避光保存。如不能立即检测，则在2～8℃下冷藏标本。如不能在8小时内完成检测，或进行标本运输时，应在－20℃下进行冷冻。由于红细胞中的叶酸水平远高于血清中叶酸水平，因此不能采用溶血标本检测血清叶酸。
2.检测红细胞叶酸时宜用EDTA和肝素抗凝，测定血细胞比容，以专用溶血试剂处理后按说明书操作。
(二)血清维生素B12测定 【原理】
化学发光法采用竞争结合的原理。血清标本经预处理使维生素B 12( vitamin，VitB 12)转化为氰钴胺形式。加入内因子-碱性磷酸酶复合物、包被羊抗鼠IgG的顺磁性颗粒和鼠抗内因子抗体，标本中的VitB 12竞争性地与内因子-酶复合物结合以阻止后者与鼠抗内因子抗体结合而固相化。在磁性分离区域进行分离和冲洗以去除未与固相结合的游离成分。再将化学发光底物加入到反应管中，与反应体系中固相化的内因子标记的碱性磷酸酶进行反应，发出的光量子被光电倍增管检测，光量子的强度与标本中的VitB 12含量成反比。
【操作方法及结果计算】
严格按试剂盒说明书进行。
【参考区间】
133～675pmol/L。
【临床意义】
血清维生素B 12降低对巨幼细胞贫血诊断有重要价值;而白血病患者血清维生素B 12含量明显增高;真性红细胞增多症、某些恶性肿瘤和肝细胞损伤时也可增加。
【注意事项】
1.不要使用溶血标本。标本在15～30℃条件下不超过8小时。若在8小时内不能完成检测即应将标本放入2～8℃冰箱冷藏。如果24小时内不能完成检测或要转运标本，则应将标本放入－20℃冻藏。
2.怀孕时VitB 12增高，服用口服避孕药和多种维生素制剂可使VitB 12增高。
三、红细胞生成素测定
【原理】
以化学发光法为例，将血清标本、小鼠单克隆抗人红细胞生成素( erythropoietin，EPO)碱性磷酸酶标记的EPO抗体和包被着山羊抗小鼠IgG的顺磁性微粒添加到反应管中。在反应管内温育完成后，结合在微粒上的免疫复合物将在磁场内被吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物添加到反应管内，对反应中所产生的光量子进行测量，其与标本内EPO的浓度成正比。
【试剂、操作方法及结果计算】
严格按试剂盒说明书进行。
【参考区间】
2.59～18.50mIU/ml。
【临床意义】 1.增高
见于缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、巨细胞贫血等疾病和肾癌、肝癌等肿瘤。
2.降低
见于肾衰竭、晚期肾病、慢性感染或代谢紊乱导致的贫血、自身免疫疾病、类风湿关节炎、AIDS、恶病质、低甲状腺功能性贫血和营养不良性贫血等疾病。
【注意事项】
1.标本不宜久置，室温( 15～30℃) 8小时内、2～8℃24小时内应完成测定。否则应在－20℃条件下冷冻保存。
2.嗜异性抗体，如人抗山羊抗体，可能会存在于患者的标本内，此类干扰性的抗体可能会导致结果的错误，需对被怀疑带有此类抗体的患者的结果进行仔细的核查。